Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Edição de 10h43min de 6 de Setembro de 2012

Reação em Cadeia da Polimerase

Técnica que amplifica uma sequência específica de DNA ( “faz cópias”) com o objetivo de torná-la abundante. Explora a capacidade de duplicação usando princípios básicos de replicação.

Princípios

Permite a amplificação do DNA ou cDNA in vitro utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável, por isso a grande importância atribuída à alternância de temperatura - termociclos) cuja atividade depende de íons Mg2+ .

Componentes

  Primeiramente, adicionam-se todos os reagentes a uma máquina chamada termociclador. Eles são: primers, taq DNA polimerase, MgCl2  (estimulam a taq DNA polimerase) , tampão (mantém pH ótimo para enzima), água, DNA molde e dNTPs.
  Depois, são seguidas estas etapas:
  1) “Melting”ou desnaturação: consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado;
  2) “Annealing” ou anelamento ou hibridização: ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado; 
  3) “Extension”  ou extensão: polimerização propriamente dita.

Termociclos

1)Desnaturação:94 ° C -96 ° C

              Separa a fita dupla do DNA molde em duas fitas simples

2)Anelamento:37 ° C- 65 °C

            Primers ligam-se aos sítios específicos na fita simples

3)Extensão:72 °

          DNA polimerase acrescenta os dNTPs à fita, de  acordo com o pareamento das bases

Desnaturação

  Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina do fragmento de DNA alvo.

Anelamento

  Os primers utilizados nessa etapa são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples que são sintetizados in vitro baseado na sequência do DNA a ser amplificado sendo esses complementares à seqüência do segmento de DNA de interesse. Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de fita dupla intacta. Deve ser feito em temperatura inferior à de desnaturação ( 45 a 70 OC).

Extensão

  A patir dos primers, a DNA-polimerase liga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples e tornando-as duplas. A DNA-polimerase não reconhece apenas o bloco de início,mas também consegue diferenciar as duas extremidades dos primers (3’ e 5’). Ela inicia a reação sempre pela extremidade 3’ do primer, completando a fita simples daí em diante, sempre na direção do fragmento procurado.

Usado na rotina médica

  Na Medicina, a técnica PCR é muito usada na eletroforese em gel agaroso, em que  auxilia na detecção e subtipagem viral, detecção de mutação e polimorfismo genético, identificação de pessoas, entre outros.

Bibliografia

http://www3.fsa.br/localuser/Biologia/Profa.%20Cristina/Aula%20nova%20PCR.pdf http://www.dag.ufla.br/site/_adm/upload/file/Luciane%20Vilela%20Resende/PCR_2 http://www2.iq.usp.br/docente/goldberg/veterinaria2006/Aula_PCRvet_2006.pdf